PCR是分子生物學(xué)研究極其重要的工具，是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，基本原理是在試管中模擬細胞內(nèi)的DNA復(fù)制，即人為創(chuàng)造核酸半保留復(fù)制條件，使目的DNA在細胞外完成擴增的過程，它可被看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制。
PCR也叫基因擴增儀，主要用于用于科研及臨床的基因擴增、定性PCR基因擴增、熒光/酶免終點定量DNA基因擴增、基因芯片等其他基因分析應(yīng)用的基因擴增等。基因擴增儀適合國內(nèi)外各種PCR試劑盒傳染病類、腫瘤類、科研類。進口基因擴增儀主要由外殼、變溫反應(yīng)腔、散熱系統(tǒng)、加熱系統(tǒng)、制冷系統(tǒng)、電子控制系統(tǒng)、供電系統(tǒng)、人機界面等各部分組成?；驍U增儀廣泛應(yīng)用于各級各類醫(yī)療機構(gòu)、大學(xué)及研究所、CDC、檢驗檢疫局、獸醫(yī)站、食品企業(yè)及乳品廠等。
“基因擴增儀”的誕生和發(fā)展
核酸體外擴增的設(shè)想最早是由Khorana在1971年提出的。“經(jīng)DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可合成tRNA基因?！?/span>
然而當時還沒有成熟的基因序列分析方法，也沒有熱穩(wěn)定DNA聚合酶以及引物合成操作很困難。這種設(shè)想達不到實際的效果。并且在70年代初出現(xiàn)了分子克隆技術(shù)，一種克隆和擴增基因的途徑被提供了，因此人們遺忘了Khorana的設(shè)想。
1983年4月的一個星期五晚上，Kary Mullis開車去鄉(xiāng)下別墅的路上,猛然閃現(xiàn)出“多聚酶鏈式反應(yīng)”的想法；
1983年12月，Mullis用同位素標記法看到了10個循環(huán)后的49 bp長度的diyi個PCR片段；
1985年，Mullis在Cetus公司工作期間，發(fā)明了PCR。Mullis要合成DNA引物來進行測序工作，卻常為沒有足夠多的模板DNA而煩惱；
1985年10月25日申請了PCR的專利，1987年7月28日批準（專利號4,683,202 ），Mullis是diyi發(fā)明人；
1985年12月20日在Science雜志上發(fā)表了diyi篇PCR的學(xué)術(shù)論文，Mullis是共同作者；
1986年5月，Mullis在冷泉港實驗室做專題報告，全世界從此開始學(xué)習PCR的方法。
根據(jù)PCR原理，商業(yè)公司在PCR儀的基礎(chǔ)功能上不斷進行創(chuàng)新和改進。至今，PCR儀已經(jīng)更新至第三代技術(shù)。為方便讀者朋友理解，本文將對三代PCR儀的原理、特點、主要廠商及產(chǎn)品、應(yīng)用領(lǐng)域做一系統(tǒng)梳理。
第一代——標準PCR儀
▲ 標準PCR反應(yīng)過程
標準PCR儀也叫做終點PCR儀，是指目的基因僅經(jīng)過預(yù)變性、變性、退火、延伸階段產(chǎn)生大量的核酸序列的PCR儀，PE-Cetus公司推出的世界上第一臺PCR自動化熱循環(huán)儀屬于此種。根據(jù)PCR退火溫度和擴增條件(細胞內(nèi)/外)，標準PCR又可以分為三類：普通PCR、梯度PCR和原位PCR。
第二代——qPCR(實時定量PCR)
1996年Applied Biosystems(現(xiàn)被賽默飛收購)公司推出了實時熒光定量PCR(RTFQ PCR)技術(shù)，并發(fā)明了世界上第一臺熒光定量PCR儀，開始了從定性到定量的跨越。
實時定量PCR儀是指在PCR反應(yīng)體系中加入能夠指示DNA片段擴增過程的熒光染料(SYBR Green等)或熒光標記的特異性的探針(TaqMan Probe等)，在普通PCR儀設(shè)計基礎(chǔ)上增加熒光信號激發(fā)和采集系統(tǒng)和計算機分析處理系統(tǒng)，形成了具有熒光定量PCR功能的儀器，通過對PCR過程中產(chǎn)生的熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR過程，再結(jié)合相應(yīng)的計算機軟件對所獲得的熒光信號數(shù)據(jù)進行分析，計算待測樣品特定DNA片段的初始濃度。
目前根據(jù)熒光信號反應(yīng)樣品濃度主要有兩種方法：
1.Taqman探針法
探針兩端分別為報告熒光基團R和熒光淬滅基團Q，當探針完整時，R發(fā)出的熒光被Q吸收，檢測不到熒光信號。探針隨機結(jié)合到DNA單鏈上，PCR擴增時，探針被水解，R與Q分離，R發(fā)出的熒光就會被檢測到。每擴增一條DNA鏈都會生成一個熒光分子。
2. SYBR Green Ι染料法
SYBR Green Ι是一種只有在和雙鏈DNA結(jié)合時才會發(fā)熒光的染料。在PCR變性時，無熒光產(chǎn)生，到了復(fù)性和延伸階段則能檢測到熒光信號。
實時熒光定量PCR儀主要應(yīng)用于病原體檢測、藥物療效考核、腫瘤基因檢測、基因表達研究、轉(zhuǎn)基因研究、單核苷酸多態(tài)性(SNP)及突變分析等細分研究方向，廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)檢測、生物醫(yī)藥研發(fā)、食品行業(yè)等研究領(lǐng)域。
第三代——dPCR(數(shù)字PCR)
不同于qPCR 對每個循環(huán)進行實時熒光測定的方法，數(shù)字 PCR 技術(shù)是在擴增結(jié)束后對每個反應(yīng)單元的熒光信號進行采集。
數(shù)字PCR是一種基于PCR反應(yīng)(聚合酶鏈反應(yīng))的單分子絕對定量技術(shù)。如圖1，在數(shù)字PCR的過程中：
(a) PCR反應(yīng)體系(含有熒光染料或探針)被分割為數(shù)以萬計的均一微液滴，
(b) 其中部分微液滴內(nèi)會含有一個或多個模板，
(c) 將這些微液滴收集到試管內(nèi)進行PCR反應(yīng)，其中含有模板的微液滴會產(chǎn)生擴增產(chǎn)物，由此具有較強的熒光，成為陽性微液滴，
(d) 在PCR反應(yīng)完成后，依次對每個微液滴內(nèi)的熒光進行檢測，
(e) 根據(jù)微液滴信號的峰值高度，繪制出微液滴熒光分布的散點圖，
(f) 通過合理的熒光分類閾值將微液滴內(nèi)的熒光強度數(shù)字化，判斷出其中具有較強熒光的陽性微液滴(圖1f中綠色的數(shù)據(jù)點，稱為“1”)和具有較弱熒光的陰性微液滴(圖1f中藍色的數(shù)據(jù)點，稱為“0”)，并通過“1”和“0”的個數(shù)來實現(xiàn)絕對定量。因此，與實時定量PCR不同，數(shù)字PCR不需要使用標準曲線，即可直接對核酸拷貝數(shù)的絕對值進行定量。
▲ 數(shù)字PCR原理示意圖
最后通過直接計數(shù)或泊松分布公式計算得到樣品的原始濃度或含量。
迄今為止，目前市面上常見的數(shù)字PCR儀器主要有兩種，根據(jù)微反應(yīng)的形成原理不同，主要分為 “芯片數(shù)字PCR”與“微滴數(shù)字PCR”兩類。
1.芯片數(shù)字PCR
▲ 芯片數(shù)字PCR原理圖
2.液滴數(shù)字PCR
▲ 微液滴數(shù)字PCR原理圖
液滴數(shù)字PCR源于乳液PCR( emulsion PCR) 技術(shù)，即將DNA模板與連接引物的磁性微球以極低的濃度(比如單拷貝) 包裹于油水兩相形成的納升至皮升級液滴中進行 PCR 擴增，擴增后的產(chǎn)物富集在磁性微球上，收集破乳后進行測序。通過油水兩相間隔得到的以液滴為單位的 PCR 反應(yīng)體系，比微孔板和 IFC 系統(tǒng)更容易實現(xiàn)小體積和高通量，而且系統(tǒng)簡單，成本低，因此成為理想的數(shù)字PCR技術(shù)平臺。
數(shù)字PCR技術(shù)主要應(yīng)用于不穩(wěn)定性分析、腫瘤早期研究、產(chǎn)前診斷、致病微生物檢測、癌癥標志物稀有突變檢測等研究領(lǐng)域，也用于驗證NGS中的低頻突變、 DNA甲基化檢測、突變多重檢測等方向。
“基因擴增儀”的結(jié)構(gòu)和原理
1、結(jié)構(gòu)
外殼、供電系統(tǒng)、電子控制系統(tǒng)、加熱系統(tǒng)、制冷系統(tǒng)、散熱系統(tǒng)、變溫反應(yīng)腔、外殼以及人機界面等共同構(gòu)成了基因擴增儀。
2、原理
PCR技術(shù)的本質(zhì)是體外核酸擴增，加熱使雙鏈DNA解開螺旋，在退火溫度條件下引物同模板DNA雜交，在Taq DNA聚合酶，dNTPs，Mg2+和合適pH緩沖液存在條件下延伸引物，重復(fù) “變性→退火→引物延伸”過程至25～40個循環(huán)，呈指數(shù)級擴大待測樣本中的核酸拷貝數(shù)。
3、基因擴增的基本要素
基因擴增的基本要素與DNA復(fù)制的基本要素是一致的。
①DNA模板：待拷貝的DNA稱為模板，它可以是雙鏈DNA也可是單鏈DNA，Z后擴增得到的產(chǎn)物是雙鏈狀態(tài)的。
②引物：是DNA復(fù)制的先鋒，就象結(jié)晶過程中的晶核，引導(dǎo)DNA的合成。在PCR擴增中一般使用合成的寡核苷酸作引物。
③DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)：是DNA復(fù)制的動力，在dNTP等底物存在時在引物的引導(dǎo)下沿著模板DNA合成互補的DNA鏈。
④緩沖液：提供DNA合成反應(yīng)所需的pH，離子強度等環(huán)境。
⑤4種單核苷酸：dNTP，提供DNA合成原料。
4、基因擴增儀原理
基因擴增儀是利用PCR技術(shù)對特定基因做體外的大量合成，用于以檢測DNA/RNA為目的的各種基因分析。
PCR反應(yīng)一般設(shè)置20~40次循環(huán)，每一循環(huán)包括高溫變性、低溫退火、中溫延伸三步反應(yīng)。每一循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個循環(huán)的模板。PCR的擴增效率很高，如果循環(huán)次數(shù)是30次，那么新生DNA片段理論上達到230拷貝(約為109個分子)。PCR反應(yīng)每個循環(huán)的三個基本反應(yīng)步驟如下：
①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA產(chǎn)物解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準備;
②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合;
③引物的延伸：溫度升到72℃左右，DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈。重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平臺期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。
“基因擴增儀”的用途和分類
基因擴增儀的用途
基因擴增儀靈敏度高，操作起來簡便、快捷，加上對特定基因樣本純度要求低，因而被廣泛地運用在以下檢測活動中:
1、醫(yī)學(xué)和健康檢驗機構(gòu)臨床診斷，用于判斷檢體中是否會表現(xiàn)某遺傳疾病的圖譜、傳染病的診斷以及基因復(fù)制。
2、DNA鑒定，常見于司法鑒定領(lǐng)域。
3、臨床分子診斷試劑和生物試劑公司藥品研發(fā)。
4、轉(zhuǎn)基因、微生物、動物源性成分檢測，常見于醫(yī)藥衛(wèi)生及農(nóng)產(chǎn)品檢驗領(lǐng)域。
基因擴增儀的分類
1. 普通的PCR儀
一次PCR擴增只能運行一個特定退火溫度的PCR儀，又叫傳統(tǒng)的PCR儀。
用途：主要是做一些簡單的、對單一退火溫度的目的基因進行擴增。
a.梯度PCR儀：一次PCR擴增可以設(shè)置一系列不同的退火溫度條件(溫度梯度)，通常為12種溫度梯度的普通PCR儀。
用途：研究未知DNA退火溫度的擴增。
b.原位PCR：將具有細胞定位能力的原位雜交技術(shù)運用于從細胞內(nèi)靶DNA的定位分析，在細胞內(nèi)實現(xiàn)基因擴增的普通PCR儀。
用途：用于在細胞的靶DNA所在位置上進行基因擴增。
2. 實時熒光定量PCR儀
PCR擴增時加入的引物利用熒光素進行標記，使引物和熒光探針同時與模板進行特異性結(jié)合，擴增結(jié)果通過熒光信號采集系統(tǒng)實時采集信號并輸送到計算機分析處理系統(tǒng)，實時輸出量化結(jié)果，這樣的PCR儀叫實時熒光定量PCR儀。
a.金屬板式實時定量PCR儀
可作為普通PCR儀使用，可帶梯度功能，可容納的樣本量大，無需特殊耗材，溫度均一性欠佳，有邊緣效應(yīng)，標準曲線的反應(yīng)條件難以做到與樣品完全一致
b.離心式實時定量PCR儀
溫度均一性較好，使用的是同一個激發(fā)光源和檢測器，隨時檢測旋轉(zhuǎn)到跟前的樣品，有效減少系統(tǒng)誤差?？扇菁{樣品量少，有的需用特殊毛細管作樣品管，增加了使用成本，也不帶梯度功能
c.各孔獨立控溫的定量PCR儀
“基因擴增儀”操作規(guī)程
普通PCR儀操作規(guī)程
1、開機操作
（1）將PCR儀電源開關(guān)打開。
（2）將PCR儀頂蓋向后平推，然后將PCR薄壁管放進去。
（3）將PCR儀頂蓋向前平推，并且均勻用力壓下反扣部分。
值得注意的是：9700PCR儀必須使用圓頭的PCR薄壁管。
2、關(guān)機操作
（1）實驗結(jié)束后，點擊EXit到主界面出現(xiàn)，將PCR電源開關(guān)關(guān)閉。
（2）均勻用力抬起反扣部分，將PCR儀頂蓋向后平推，將PCR薄壁管取出。
（3）將PCR儀頂蓋向前平推。
熒光定量PCR儀操作規(guī)程
1.開始運行儀器
將PCR儀底座開關(guān)打開，再將定量PCR儀檢測器開關(guān)打開。在實驗之前，首先對系統(tǒng)預(yù)熱半個小時，打開電腦，將iQ5軟件啟動。
2.放置樣品
在0.2ml的薄壁管或96孔板內(nèi)加入PCR反應(yīng)體系，將管蓋蓋上，注意，不要讓手指和反應(yīng)管表面有接觸，所以必須將一次性塑料手套戴上。按照順序在儀器的加熱孔中放入反應(yīng)管。
3.設(shè)置程序，運行試驗
定量PCR軟件的基本操作步驟如下：
（1）對熱循環(huán)程序文件進行設(shè)置。
（2）對反應(yīng)管文件進行設(shè)置。
（3）點擊“run”鍵，將程序運行。
（4）數(shù)據(jù)分析
4.結(jié)果分析
（1）PCR反應(yīng)結(jié)束后，標準曲線和Ct值軟件會自動計算。
（2）可以在軟件窗口選擇相應(yīng)的分析功能進行表達量分析，等位基因分析。
（3）點擊右上方的“Report”鍵，還能夠?qū)⒔Y(jié)果報告單輸出。
5.關(guān)閉運行儀器
實驗結(jié)束后將iQ5軟件、熒光定量檢測器及擴增系統(tǒng)電源關(guān)閉，將電腦關(guān)閉，將反應(yīng)管取出。
“基因擴增儀”的常見問題及故障
常見問題
1.為什么在不同型號的PCR儀上擴增出的條帶亮度有差異？
答：不同的PCR儀有不一樣的優(yōu)化的升降溫策略，因此當向另一類PCR儀轉(zhuǎn)移這類CR儀上使用的PCR步驟參數(shù)上時，需要進行試驗優(yōu)化。
2.在PCR實驗結(jié)束后我的樣品可以一直放在PCR儀中低溫保存嗎？
答：Z好不要，建議在程序運行結(jié)束之后，應(yīng)當將樣品從PCR儀中及時取出。當?shù)蜏乇４鏁r，盡量設(shè)定比較高的溫度，能夠使得儀器的使用壽命延長。
3.模擬管和樣品臺控溫模式有什么差別？
若采用樣品臺控溫模式，當將樣品臺升降溫到目標溫度時，因為傳熱延遲，樣品管內(nèi)樣品達到目標溫度仍需要較長的時間，因此，當步驟時間在30s以下時，Z好使用模擬管控，若要使用樣品臺控溫模式，那么Z好延長一倍步驟時間。
4.反應(yīng)后反應(yīng)管壁出現(xiàn)液滴？
可能原因1：在程序運行前，熱蓋加熱功能沒有被開啟。
方法：將熱蓋加熱功能開啟。
可能原因2：在反應(yīng)結(jié)束后，過長時間的低溫保存。
方法：在結(jié)束運行后，熱蓋將自動關(guān)閉，因此會出現(xiàn)冷凝，這不會影響實驗的結(jié)果，在離心機上放置反應(yīng)管，瞬時離心使液滴回到管子底部就行。
5.使用的微孔板，反應(yīng)后反應(yīng)液有明顯蒸發(fā)？
方法：
（1）保證使用的微孔板質(zhì)量很好，在反應(yīng)之前，要密封嚴格。
（2）保證熱蓋蓋緊，將熱蓋的溫度適當提高。
（3）將反應(yīng)體積增大。
6.使用PCR管，反應(yīng)后部分PCR管內(nèi)反應(yīng)液有明顯蒸發(fā)？
方法：
（1）確保使用的PCR管質(zhì)量很高。
（2）將四個同樣的空PCR管分別置于樣品臺的四角，從而使證熱蓋壓在各PCR管上的壓力均勻得到保證。
常見故障
1.加熱或者冷卻速度緩慢
出現(xiàn)這樣的情況，原因可能是控制器或機械故障，需要運行診斷測試并記錄加熱速率。
2.開機時，出現(xiàn)錯誤信息
這種情況有可能是儀器某一系統(tǒng)啟動失敗或者電壓太低造成的。確保同一電路中沒有使用其他電器，不要在已有用電器電路上增設(shè)線路。
3.打開電源然而儀器不響應(yīng)
出現(xiàn)這種情況，很可能是因為插座沒有插緊或者電源線脫落，只要重新插入電源就行。
4.屏幕不顯示并且馬達和風扇不啟動
出現(xiàn)這種情況，很有可能是總保險絲被熔斷，只要將保險絲更換就能使故障排除。
5.插上電源屏幕空白或，按下某鍵屏幕不顯示相應(yīng)畫面
出現(xiàn)這樣的情況，很可能是邏輯電路或者電源的保險絲被熔斷，也有可能是因為控制器，對保險絲進行更換，如果不能恢復(fù)正常，那么就咨詢維修工程師。
“基因擴增儀”維護保養(yǎng)及注意事項
盡管PCR儀器不是計量儀器，然而其的作用原理和基本計量要素有很密切的關(guān)系，因此，PCR儀需要定期檢測和維護。
儀器的維護保養(yǎng)
1．樣品池的清洗
首先將蓋子打開，然后在樣品池加入95%乙醇或10%清洗液，浸泡5min，然后對被污染的孔進行清洗，使用微量移液器對液體進行吸取，使用棉簽將剩余液體吸干。打開PCR儀，設(shè)定保持溫度為50℃使PCR程序運行，揮發(fā)去除殘余液體，通常只需要5-10分鐘左右。
2.熱蓋的清洗
對于熒光定量PCR儀，若出現(xiàn)熒光污染，并且樣品池不是這一污染的來源，或者當熱蓋的松緊受到污染或殘跡物的影響時，墊蓋底面需要用壓縮空氣或純水清洗，使樣品池的孔干凈，無污物阻擋光路得到保證。
3.儀器外表面的清洗
對儀器的外表面進行清洗能夠使灰塵和油脂除去，然而不能達到消毒的效果，對PCR儀的外表面進行清洗Z好選擇沒有腐蝕性的清洗劑。
4．更換保險絲
首先關(guān)掉PCR儀，將插頭拔取，將電源插口旁邊的保險盒打開，將備用的保險絲換上，觀察是否恢復(fù)正常。
儀器的維護和保養(yǎng)的注意事項
1)PCR儀器需要視制冷方式而定通常進行半年至少一次定期檢測。
2)PCR反應(yīng)的要求溫度與實際分布的反應(yīng)溫度不相同，如果通過檢測，與設(shè)置溫度相比較，各孔平均溫度差超過1～2℃，那么可以對PCR實際反應(yīng)溫度差運用溫度修正法來糾正。
3)升、降溫過程的時間控制是PCR反應(yīng)過程的關(guān)鍵時間越短越好，如果PCR儀的降溫過程高于1分鐘，那么就應(yīng)該對儀器的制冷系統(tǒng)進行檢查。當PCR儀是使用風冷制冷時，其反應(yīng)底座的灰塵要較徹底地清理，若是其他的制冷系統(tǒng)，那么應(yīng)該對相關(guān)的制冷部件進行檢查。
4)通常情況下，如果儀器的溫度能夠采用溫度修正法糾正，那么不要輕易地對儀器的電子控制部件打開或調(diào)整。
山東博科-基因擴增儀
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